工作流程
开发色谱分析方法通常需要耗费很多时间，而且难度很大。传统方法通常是选择一个优选或经常使用的溶剂、pH值、缓冲液和色谱柱组合作为开始点，然后对流动相组成进行调节，直到摸索出满意的方法。但此过程非常费力，而且经常得不到满意的方法。更系统性的方法是利用良好的实验设计和根据本大纲中描述的工作流程，高效快速开发高质量的反相色谱分析法。本方法开发工作流程包括测试方法摸索，其对如pH值、有机改性剂和色谱柱化学性质等选择性因素进行评估，测定那些能够通过控制选择性从而实现所需分辨率的最有效的试验参数，然后对摸索试验得到的最优分离方案进行优化或微调以得到最终分析方法，然后对分析方法进行验证以确保满足预期方法目标。
开始点
为了设计一个有效的测试方法摸索试验，尽可能多地搜集关于样品和被分析物化学特性的信息是很重要的。
方法开发所需信息
样品溶解性能：
被分析物数量：
--需要分离多少分析对象色谱峰？
化学结构：
功能基团：被分析物有何区别？
--有无可电离基团？电离常数？
--pH值如何影响色谱分析？
检测：
--需要或可能采用何种检测？
--被分析物是否有紫外吸收？
--λmax?
浓度范围和定量要求？
--需要多高检测水平？
--需要多大定量限？
样品基质影响：
--是否有阻碍分离或检测的基质影响？
方法使用目的
在开发一种测试方法之前，还需要考虑，是否理解和明确了测试方法的目标和使用目的，清楚理解使用目的将有助于确定必须要满足的性能参数以及验证方法所需关键参数，例如可能需要从样品的所有组分中分离一种对象被测物的方法，或者可能需要既能从其它组分中分离对象被测物、也能使所有组分之间能够相互分离的方法，其它考虑因素可能还包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。我们采用开发从相关化合物中分离帕罗西汀的方法来展示系统方法。
测试方法摸索
当选择合适的色谱柱时，不同基体颗粒(杂化、硅胶、聚合物)的特性差别，会造成保留性能、选择性的差别，了解这一点是很重要的。根据基质表面残余的硅醇基团数量的不同以及封端原因，可能会导致次级效应，另外不同的键合相可导致显著的选择性差别以及其它特性。
不同配体、不同选择性
疏水性
-更长的烷烃链提供更长的保留时间。
硅醇活性
-影响谱峰对称性和次级效应。
水解稳定性
-颗粒键合位点上配体数量越多，色谱柱寿命越长。
配体密度
-影响样品负载能力。
用传统的HPLC 设备对具有不同pH值和有机改性剂的大量色谱柱进行摸索试验需要大量时间，而使用安装了ACQUITY UPLC 色谱柱管理器和填充了亚-2微米颗粒的高分辨率短色谱柱的ACQUITY UPLC®设备，可使试验从几天缩短到几小时。
色谱柱摸索试验：使用安装了ACQUITY UPLC 色谱柱管理器和ACQUITY UPLC 色谱柱的ACQUITY UPLC 设备测试摸索条件如图所示，图示这些条件的最终目标是得到一系列不同的色谱图，其能提供选择合适色谱柱所需信息。BEH C18色谱柱是非常好的通用C18，适于宽pH值范围使用，BEH Shield RP18 为烷烃链C18提供选择性补充，BEH Phenyl 色谱柱为这两种C18色谱柱提供选择性补充，为了满足极性保留的试验设计需求，也可选用HSS T3 色谱柱。
pH 值的影响
影响带如下可电离基团等的被测物。
-胺
-羧酸
-酚
有的化合物带一个或更多可电离基团
-pH值变化可产生最强的选择性效果
反相保留性能：分析pH值如何影响反相色谱分析中的保留时间和稳定性是很重要的，为了得到可电离化合物的最佳保留性能，被测物不应带电或被离子化，因此酸性被测物应该使用低pH值，碱性被测物应该使用高pH值，中性材料不带可电离基团，因此不受pH值影响。这些曲线也可被看作滴定曲线，其拐点是分子的表观pKa 值，因为pH值的微小变化就能导致保留时间和选择性的急剧变化，所以测试方法采用的pH值不能位于分子pKa 附近，稳定区域是曲线的水平位置部分
pH值选择和色谱柱选择：此色谱图中，由于帕罗西汀及其相关化合物的带电状态发生变化，pH 10 比pH 3 在BEH C18色谱柱上的保留时间更长，在这一点上，由于具有更高分辨率和更好的选择性，pH 10 是适合被测物的pH值。下一步是评估在相同pH 10 值下三种不同色谱柱的色谱图，以选择具有最佳分辨率的色谱柱。与其它纯硅胶色谱柱相同，HSS T3 色谱柱只能用于pH值2-8环境下，因此不在评估之列，三种色谱柱都显示了可检测所有组分的能力，由于C18的通用性，因此选择BEH C18色谱柱来对比不同有机改性剂的选择性。
选择有机改性剂
用于反相分离的典型溶剂是甲醇和乙腈，除了通用性外，还具有良好的化学特性，两者的洗脱能力和粘度不同，甲醇中存在氢键，具有不同的独特选择性
甲醇
-弱洗脱剂
-带氢键溶剂
乙腈
-非质子溶剂
-强洗脱剂
-低粘度
选择溶剂：如上色谱图显示，甲醇是比乙腈更弱的洗脱剂，因此表现更长的保留时间，而乙腈对此类被测物中的所有组分具有更好的分离性能，因此采用BEH C18色谱柱和乙腈溶剂在pH值为10的条件下继续优化分离。
测试方法优化
可通过对参数进行调节以微调和优化分离过程，物理参数-梯度坡度可用于调节保留性和选择性，但需要记住的是梯度坡度经常是分辨率和选择性的综合平衡结果。另一个可优化参数是温度，任何化学过程都受温度影响，温度不同可导致选择性的巨大差别。
色谱分析方法开发：当相关化合物浓度降低时，帕罗西汀相关化合物B和D的分辨率会急剧降低，这是由于其和帕罗西汀峰的浓度水平不相称造成的，需要继续优化。
更小的梯度坡度可提高分辨率
-降低梯度坡度将降低灵敏度。
更陡的梯度坡度将压缩谱峰，经常会降低分辨率。
-增加梯度坡度将增加灵敏度。
改变梯度坡度需要平衡谱峰高度和灵敏度。
保留性能和选择性的变化。
方法优化和温度
降低移动相粘度。
降低背压。
-如果流动速度维持恒定。
改善被测物分散性。
-优化线性速度更高。
保留性能和选择性的变化
温度会影响中间的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。
色谱分析方法优化：此例子中，温度以15?C的步幅从30?C开始上升到40?C和60?C，随着色谱柱温度增加，组分的分离性能改善，另外被测物的分散性提高，谱峰更尖锐，色谱柱温度为60?C时分离效果最佳。
方法验证和注意点
方法验证用于确认分析方法的特性能否满足应用要求，验证过程中需要评估的典型色谱法特性是专属性、线性、范围、检测限、定量限、准确度、精度、耐用性。
分析方法验证
分析方法验证经常是由多个步骤组成的反复人工过程，需要进行大量的色谱测试，以充分评估所有八种特性，审视、计算和管理这些过程获得的所有数据可能具有一定的难度。EmpowerTM 2 Method Validation Manager 采用自动化的验证过程，使数据审视更加顺畅，极大提高了验证过程的效率和可靠性。
结论
通过使用包括摸索试验和优化的方法开发系统策略可明显提高色谱测试方法的开发效率。
设计试验研究包括影响选择性的多个参数，例如固定相、pH 值、有机改性剂，自动化运行极大加速了测试方法开发流程。
合理审视数据后，完成最终测试方法经常是微调和优化如梯度坡度和温度等变量的过程。
为了保证所开发的方法能够满足应用要求，需要使用事先确定的性能参数对方法进行验证。